赭曲霉毒素A快速檢測試劑盒（ELISA法）

使用說明書

（酶聯(lián)免疫法）

 1 原理及用途

赭曲霉毒素是曲霉菌屬和青霉菌屬的某些種產(chǎn)生的二級(jí)代謝產(chǎn)物。其中赭曲霉毒素A在自然界分布對人類和動(dòng)植物影響大。

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測米面、花生、大豆等谷物及飼料樣本中的赭曲霉毒素(Ochratoxins A，OTA)，試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的赭曲霉毒素和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗赭曲霉毒素抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含赭曲霉毒素含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中赭曲霉毒素的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：0.1ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：37℃，30min～30min～15min

2.3 檢測下限：

谷物…………………………1ppb

飼料…………………………2ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

赭曲霉毒素A…………………………………100%

2.5 樣本回收率：

谷物及配合飼料…………………………85%±15%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)品（黑蓋）：各1ml

0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………11ml

抗體工作液（藍(lán)蓋）………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

說明書…………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個(gè)

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：70%甲醇

V甲醇:V水=7:3(7份甲醇加3份去離子水)。

配液2: 0.1M碳酸氫鈉溶液

    稱取4.2g碳酸氫鈉，加入去離子水混勻溶解，定容至500ml。

配液3: 工作洗滌液

    滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 食品類谷物（大米、玉米、小米等）處理方法

1）稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中，加10ml 70%甲醇,振蕩5分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取1ml上清，加入1ml 0.1M碳酸氫鈉溶液，振蕩；

3）取50μl進(jìn)行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測下限：1ppb

5.3.2飼料處理方法

1）稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中，加20ml 70%甲醇,振蕩5分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取1ml上清，加入1ml 0.1M碳酸氫鈉溶液，振蕩；

3）取50μl進(jìn)行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測下限：2ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

6.1 編    號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光反應(yīng)30分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加350ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，后一次拍干（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 加酶反應(yīng)：加酶標(biāo)記物100µl/孔，37℃避光反應(yīng)30分鐘。

6.5 洗    滌：同上

6.6 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光顯色15分鐘（若藍(lán)色過淺，可適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間）。

6.7 終    止：加終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.8 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實(shí)際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。

8 注意事項(xiàng)

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 赭曲霉毒素A快速檢測試劑盒（ELISA法）貯藏及保存期

儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。